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    用于酶學(xué)參考測(cè)量的分光光度計(jì)的性能評(píng)價(jià)
    更新時(shí)間:2018-11-08 點(diǎn)擊次數(shù):2132

    分光光度計(jì)是參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵設(shè)備之一,評(píng)價(jià)分光光度計(jì)的性能是否符合要求對(duì)酶學(xué)參考測(cè)量工作的 有效開(kāi)展非常重要。方法 分光光度計(jì)基本性能指標(biāo)需經(jīng)北京市海淀區(qū)計(jì)量檢測(cè)所檢定。本實(shí)驗(yàn)室參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室 標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)( Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) EP 系列文件,結(jié)合參考實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn),利用以 AgilentCary100 分光 光度計(jì)為主要設(shè)備的參考測(cè)量檢測(cè)系統(tǒng),按照臨床化學(xué) 和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì) ( International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine,IFCC) 公布的一級(jí)參考測(cè)量程序( 37℃ ) 對(duì)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( ALT) 、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( AST) 、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶( GGT) 進(jìn)行測(cè)定,評(píng)價(jià)系統(tǒng)的基本性能參數(shù)、精密度、正確度、分析測(cè)量范圍。結(jié)果 AgilentCary100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本性能指標(biāo)經(jīng)海淀區(qū)計(jì)量檢測(cè)所檢定,結(jié)果示透射比示值誤差、透射比重復(fù)性、波長(zhǎng)示值誤差、波 長(zhǎng)重復(fù)性、噪聲、雜散光均在允許誤差范圍內(nèi)。ALT、AST、GGT 三種酶測(cè)定的總變異系數(shù)( CV) 均小于 1% 。測(cè)定有證參考物 質(zhì)( ERM) 和參考實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃( RELA) 樣本檢測(cè)結(jié)果的均值和相對(duì)偏倚均在允許的范圍內(nèi)。ALT、AST、GGT 三 種酶的分析測(cè)量范圍上限分別為 240U /L,330U /L,310U /L,均接近或高于 IFCC 公布的參考方法的上限。結(jié)論AgilentCary100 分光光度計(jì)的性能條件符合酶學(xué)參考測(cè)量的要求,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

    作為參考測(cè)量系統(tǒng)的重要組成部分,分光 光 度 計(jì)的性能直接 影 響 檢 測(cè) 結(jié) 果 的 準(zhǔn) 確 性 和 可 靠 性,同 時(shí),參考測(cè)量領(lǐng)域?qū)x器設(shè)備的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性提出 了更高的要求,因此,需要對(duì)分光光度計(jì)的性能進(jìn)行 系統(tǒng)評(píng)價(jià),保證參考測(cè)量結(jié)果的科學(xué)、準(zhǔn)確。丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶( ALT) 、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( AST) 、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn) 肽 酶 ( GGT) [1] 是酶學(xué)參考測(cè)量的常規(guī)項(xiàng) 目,也是肝功能檢測(cè)的基 本項(xiàng)目。 作 為 通 過(guò) ISO17025 認(rèn)可的參考測(cè)量 實(shí) 驗(yàn) 室,本 實(shí) 驗(yàn) 室 已 建 立 包括天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的參考方法[2],且 多年來(lái)應(yīng)用 Thermo Evolution 300 分光光度計(jì)為關(guān)鍵 測(cè)量設(shè)備之一參加 RELA 及衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)成績(jī)均 合格[3],證明本實(shí)驗(yàn)室整個(gè)參考測(cè)量系統(tǒng)符合參考 測(cè)量工作的 要 求。為更好的開(kāi)展參考測(cè)量工作,本 實(shí)驗(yàn) 室 引 進(jìn) 了 Agilent Cary100 紫 外 可 見(jiàn) 分 光 光 度 計(jì),作為酶學(xué)參考測(cè)量的關(guān)鍵設(shè)備之一,在啟用新的 分光光度計(jì)前 需 要 經(jīng) 過(guò) 性 能 評(píng) 價(jià) 試 驗(yàn),證 明 此 分 光 光度計(jì)性能指標(biāo)符合參考測(cè)量要求。 材料和方法 1 材料 1. 1 儀器 美國(guó) AgilentCary100 紫外可見(jiàn)分光 光 度 計(jì); 美 國(guó) Fluke 1521 點(diǎn) 式 溫 度 計(jì) ( 精 度 為 0. 001℃ ) ; 德國(guó) Eppendorf reference 型 移 液 器; 德 國(guó) Sartorius 電子天平( 精度為 0. 01mg、0. 1mg 各 1 臺(tái)) ; 美國(guó) Hamilton Microlab500 稀釋配液儀; 瑞士梅特勒- 托利 多 SevenMulti 型; 美 國(guó) Thermo Haake B12 型 水 浴鍋。 1. 2 試劑 三羥 甲 基 氨 基 甲 烷、L-丙 氨 酸、α- 酮戊二 酸、還 原 型 β-煙 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 二 鈉 鹽、吡哆醛-5 磷酸、氯 化 鈉、疊 氮 鈉、丙 酮 酸、L-天 門(mén) 冬氨酸、氫氧化鈉、草酰乙酸、N-甘氨酰甘氨酸,L-γ- 谷氨 酰-3-羧 基-4-硝 基 苯 胺、單 氨 酸 鹽、一 水 化 合 物、乳酸脫氫 酶、牛 血 清 白 蛋 白 均 購(gòu) 自 Sigma 公 司; 蘋(píng)果酸脫氫酶來(lái)源于 Roche 公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離 子水,電導(dǎo)率 > 18 兆歐。 1. 3 樣 本 精 密 度 試 驗(yàn) 樣 本 來(lái) 自 于 Roche 公 司生產(chǎn)的多項(xiàng)生化校準(zhǔn)品( c. f. a. s,批號(hào): 171651) , 以及往年的 RELA 樣本。正確度試驗(yàn)樣本來(lái)自于歐 共體參考物質(zhì)與測(cè)量研究所制備的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) ( ERM-AD454k /AD457 /AD452) ,以及 2016 年 RELA 樣本。分析測(cè)量范圍試驗(yàn)樣本采用人新鮮血清,高 值樣本采用添加法制備。 2 方法 1. 3 基本性能指標(biāo)評(píng)價(jià) AgilentCary100 紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)基本性能由北京市海淀區(qū)計(jì)量檢測(cè) 所按照 JJG178-2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì) 檢定規(guī)程》對(duì) 波 長(zhǎng)、透 射 比、噪 聲、雜散光等進(jìn)行檢 定。在 340nm 處,帶 寬 2nm,每 秒 測(cè) 定 一 次 吸 光 度, 共連 續(xù) 監(jiān) 測(cè) 2 小 時(shí),計(jì) 算 吸 光 度 隨 時(shí) 間 的 變 化 率。 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)( CLSI) EP15-A2 文 件[4],選擇 c. f. a. s 樣本,以及往年留存的室間質(zhì)評(píng) 樣本,按照要求進(jìn)行復(fù)溶,對(duì) ALT、AST、GGT 三個(gè)項(xiàng) 目按照 IFCC 公布的參考測(cè)量程序連續(xù)檢測(cè) 5 天,每 天 1 批,每個(gè)樣本重復(fù) 4 次。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 3 正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 參考 CLSI 頒 布 的 EP15-A2 文 件,分 別 對(duì) ERM 和 RELA 2016 樣本進(jìn)行檢測(cè): ( 1 ) 檢 測(cè) ERM-AD454k /AD457 /AD452,根 據(jù) ERM 體積特點(diǎn),共檢測(cè) 3 ~ 8 次,計(jì)算均值,判斷其是 否在標(biāo)示 值 不 確 定 度 范 圍 內(nèi); ( 2 ) 測(cè) 定 RELA 2016 A、B 樣本,每批 2 次重復(fù),測(cè)定 5 天,計(jì)算均值,并與 RELA 公布的所有實(shí)驗(yàn)室均值比較,觀察其是否在給 定的置信區(qū)間內(nèi)。 4 分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià) 參考 CLSI EP6-A[5] 文 件,選 擇 覆 蓋 IFCC 文 件 提供線性范 圍 的 20% ~ 30% 的 高( H) 、低( L) 濃 度 水平混合血清,低濃度樣本為人新鮮血清,高濃度樣 本為人新鮮血 清 添 加 室 間 質(zhì) 評(píng) 樣 本 制 得,按 比 例 配 制成 6 個(gè)系列濃度樣本,每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè) 4 次,將 所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)。 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 17. 0 軟件系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s) 、變 異 系 數(shù) ( CV) 以及回歸等相關(guān) 分析。 結(jié) 果 1 基本性能指標(biāo)結(jié)果 基本性能指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表 1。 表 1 Agilent Cary100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢定結(jié)果 項(xiàng)目 檢測(cè)結(jié)果 允許誤差 波長(zhǎng)示值誤差( nm) 0. 6 ± 6. 0 波長(zhǎng)重復(fù)性( nm) 0. 0 ≤3. 0 透射比示值誤差( % ) - 1. 5 ± 2. 0 透射比重復(fù)性( % ) 0. 1 ≤1. 0 雜散光( % ) 0. 1 ≤2. 0 噪聲 0% 線( % ) 0. 0 ≤0. 5 100% 線( % ) 0. 0 ≤1. 0 吸光度穩(wěn)定性( abs/ h) - 0. 000124 ± 0. 0003 2 精密度評(píng)價(jià)結(jié)果 ALT、AST、GGT 總不精密度指標(biāo)均小于 1% ,見(jiàn) 表 2。

    3 正確度評(píng)價(jià)結(jié)果 按 照 IFCC 公 布 的 參 考 測(cè) 量 程 序 檢 測(cè) ERMAD454k /AD457 /AD452,結(jié) 果 均 在 有 證 標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì) 的 標(biāo)示值不確 定 度 范 圍 內(nèi)。測(cè) 定 RELA 2016 A、B 樣 本,其均值均在給定的置信區(qū)間內(nèi)。

    4 分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià)結(jié)果 對(duì) ALT、AST、GGT 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性模型回歸 分析,其回歸系數(shù) R2 > 0. 999,其在建立的分析測(cè)量 范圍內(nèi)成線性,見(jiàn)圖 1、圖 2、圖 3。ALT、AST、GGT 分 析測(cè)量范圍上限分別為 240U /L,330U /L,310U /L, 均接近或高于 IFCC 公布的參考測(cè)量程序的檢測(cè)上 限,線性回歸模型及回歸方程見(jiàn)。

    參考測(cè)量程序和參考實(shí)驗(yàn)室處于溯源鏈的上 游[6-8],參考測(cè)量工作對(duì)試劑、儀器、人員等各方面的 要求都較 高,我國(guó)酶學(xué)參考測(cè)量網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)建立[9]。 作為酶學(xué)參考 測(cè) 量 工 作 的 關(guān) 鍵 設(shè) 備 之 一,分 光 光 度 計(jì)的性 能 至 關(guān) 重 要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè) ALT、AST、 GGT 這三項(xiàng)已 通 過(guò) CNAS 認(rèn)可的參考測(cè)量項(xiàng)目,同 時(shí)從多角度全面評(píng)價(jià) Agilent Cary100 分光光度計(jì)的 性能,評(píng)價(jià) 結(jié) 果 準(zhǔn) 確、可 靠。在 精 密 度 評(píng) 價(jià) 中,GGT 項(xiàng)目檢測(cè) c. f. a. s 總 變 異 系 數(shù) 小 于 檢 測(cè) 往 年 RELA 樣本的變異系數(shù),而前者的濃度較低,考慮可能的原 因?yàn)榇藢?shí)驗(yàn)中 所 用 的 RELA 樣 本 存 放 過(guò) 久,樣 本 本 身的不穩(wěn)定性較大,導(dǎo)致其測(cè)定結(jié)果 CV 較大。在精 密度評(píng)價(jià)結(jié)果中,雖然此實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)目檢測(cè)總 CV 均小 于 1% ,而本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量目標(biāo)為總 CV 小于 2% ,,這 是考慮到淀粉 酶、葡萄糖等變異較大的項(xiàng)目綜合自 身檢測(cè)能力而 制 定 的,這也與國(guó)內(nèi)其他實(shí)驗(yàn)室的實(shí) 驗(yàn)室質(zhì)量控制目標(biāo)一致[10]。與 Thermo Evolution 300 分光光度 計(jì) 相 比[11],Agilent Cary100 分 光 光 度 計(jì) 對(duì) 溫度控制更加穩(wěn)定,受外界環(huán)境溫度影響小,批間重 復(fù)性好,這主要是由于加熱模塊的工作原理不同, Agilent Cary100 分光光度計(jì)采用水循環(huán)加熱,Thermo Evolution 300 分光光度計(jì)采用半導(dǎo)體模塊加熱,前者 溫度控制更穩(wěn)定,但也存在更改溫度設(shè)置后,溫度變 化響應(yīng)速度慢 的 缺 點(diǎn),需要試驗(yàn)人員對(duì)試驗(yàn)環(huán)節(jié)的 準(zhǔn)確控制,才能保證參考測(cè)量程序的有效執(zhí)行。同 時(shí),Agilent Cary100 分光光度計(jì)可同時(shí)進(jìn)行多杯檢 測(cè),且重復(fù)性較好,利于提高試驗(yàn)效率。 Agilent Cary100 紫外可 見(jiàn) 分 光 光 度 計(jì) 的 性 能 條 件符合酶學(xué)參考測(cè)量的要求,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

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